LAB-Transfección

LAB-Transfección

Published on 15 May 2022

lab transfección 293T vector eGFP

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Transcript
00:01
Preparación de medios
00:03
Preparación de los diferentes medios de cultivo
00:06
MATERIALES DMEM-->medio basal FBS --> nutrientes AB/AM -->antibiótico
00:34
Medio 1: DMEM 10% FBS + 1% AB/AM Medio 2: DMEM/F12 10% FBS + 1% AB/AM Medio 3: DMEM 1% FBS + 1%AB/AM Medio 4: DMEM 0,5% FBS + 1% AB/AM
00:50
Transfección, descelularización y recelularización
00:50
Experimento 1
00:52
Transfección línea celular 293T con un vector que contiene el gen eGFP
00:53
Parte 1
00:60
Transfección línea celular 293T con un vector que contiene el gen eGFP
01:01
MATERIALES
01:02
Línea celular 293-T DMSO DMEM 10% FBS Trypan blue
01:02
Cloroquina Plásmido [0.5ug/uL] CaCl2 H2O2 HBS 2X PBS Tripsina
01:11
1. Descongelar 293-T (37ºC) con baño de agua. 2. Añadir 3mL DMEM 10% y 1mL células 293-T 3. Fracciones a). Viabilidad microscopio 50uL célullas 293-T + 50uL Trypan blue --> 10uL c.Neubauer b). Centrífuga 7' 1000rpm Eliminar sobrenadante. Resuspender en 5mL DMEM 10%FBS Sembrar 2 pocillos --> 0.75 * 10^6 Células/pocillo 4. Incubar O.N
01:52
5. Añadir 4.5mL DMEM 10%FBS y 1.5uL cloroquina -->2.25mL/pocillo 6. Incubar 1h 37ºC 7. Preparar el plásmido - 5ug plásmido [0.5ug/uL] - 30uL CaCl2 Llevarlo hasta 250uL con H2O2 Añadir 250uL HBS 2X y burbujear 30-40s Añadir a los pocillos gota-gota 8. Incubar 6h 9 Cambiar medio e incubar O.N
02:21
12. Eliminar el medio y lavar con 1mL PBS 13. 500 uL tripsina/pocillo e incubar 5' a 37ºC 14. Añadir 3mL DMEM 10% FBS y las células 15. Fracciones a). Viabilidad b). Centrífugga --> 7' 1000rpm -->DMSO Resuspender --> criovial 16. Descongelar 1' 37ºC
02:27
Evolución del proceso